Nanopore納米孔測序技術(shù)

      納米孔測序技術(shù)如今飛速發(fā)展。以Nanopore納米測序儀為例，它在Nanopore芯片的基質(zhì)上錨定一個“孔道蛋白”，該蛋白可以和“motor蛋白”結(jié)合。“motor蛋白”可以將DNA雙螺旋解開成單鏈，并控制單鏈通過“孔道蛋白”。當(dāng)DNA單分子穿過“孔道蛋白”時，不同的堿基會帶來不同的電流變化，孔道中的感受器能夠感知這種變化。根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式識別算法得到堿基序列
（圖1）。

圖1 納米孔測序原理示意圖。DNA分子被motor蛋白解螺旋后通過孔道蛋白，產(chǎn)生電流變化。

     儀器特點：
• 實時讀取堿基序列，不需要后期集中對測序信號進行二次解讀
• DNA/RNA直接測序，RNA不需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄再測序
• 超長讀長，可以達到“M bp”級別
• 高保真度，因為不需要進行PCR擴增，避免了引入突變
• 可以檢測堿基修飾
      特點展示1：實時測序
    “Motor蛋白”有兩個作用，一個是將捕獲的DNA分子進行解螺旋，變成單鏈分子；另一個是控制單鏈分子進入納米孔的速度。當(dāng)DNA分子上不同的堿基通過納米孔時，會產(chǎn)生不同的電流變化，這種變化被實時記錄下來，然后快速進行數(shù)據(jù)庫檢索和匹配，從而解析出對應(yīng)的堿基類型（圖2）。目前的測序速度可以達到，DNA 450bp/秒，RNA 70nt/秒。

圖2 納米孔測序儀對堿基序列的實時解讀。

      特點展示2：納米孔測序直接解讀RNA中修飾核苷酸
      傳統(tǒng)的rRNA基因或rRNA cDNA拷貝的高通量測序（二代測序，方法是SBS）已廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育研究和臨床鑒定傳染性生物。然而，通過“邊合成邊測序（SBS）”的方法移除了rRNA的表觀遺傳修飾信息。納米孔測序的一個顯著優(yōu)勢，是可對天然DNA和RNA進行直接分析并解析堿基修飾。這種直接RNA測序技術(shù)有望快速鑒定環(huán)境和患者樣本中的微生物。

圖3 納米孔測序儀直接測序RNA。RNA修飾可以作為微生物鑒定的指標(biāo)，同時納米孔測序儀的長讀長可以幫助提高分類準(zhǔn)確性。

      應(yīng)用領(lǐng)域：
      納米孔測序儀憑借其超長讀長、便捷的建庫、實時測序、能進行表觀遺傳分析等諸多優(yōu)點，在測序領(lǐng)域逐漸得到廣泛的應(yīng)用。目前，在微生物耐藥性/致病性，微生物宏基因組，人類遺傳學(xué)研究，癌癥研究，轉(zhuǎn)錄組分析等領(lǐng)域，Nanopore測序儀正帶來越來越多的研究成果。
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